近日，南京农业大学棉花遗传与种质创新利用团队在国际著名学术期刊Nature Communications在线发表了题为“Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity”的研究论文。该研究鉴定到一个具有独特串联重复DOMAIN的新型真菌毒性蛋白VdTRP并揭示了其致病机制；解析了棉花一个细胞壁关键蛋白类几丁质酶CTL1在质外体与VdTRP互作，阻止VdTRP靶向细胞膜诱导细胞死亡的抗病机制；提出基于病菌毒蛋白的寄主互作靶标关键基因发掘及提高作物抗病性的育种利用策略。
病原真菌是世界范围内农业可持续发展的主要威胁之一。2022年，联合国粮农组织（FAO）报道全球168种作物受到数百种真菌病害的影响。黄萎病菌（Verticillium dahliae）是一种土壤传播、半活体营养型的丝状真菌。它通过根部侵染，在维管系统中定殖，导致寄主出现萎蔫症状，进而引发包括棉花在内的多种作物发生黄萎病，严重影响作物产量和品质。由于化学杀菌剂很难有效控制黄萎病危害，培育抗病品种是经济可行的最有效途径。众所周知，病原菌会产生大量效应因子抑制植物免疫防御，或产生毒素直接诱导细胞死亡，促进其感染。发掘黄萎病菌关键效应蛋白，开展基于病菌效应蛋白的寄主互作靶标鉴定与育种利用是提高作物抗病性的重要策略之一。
为了促进寄主植物的定殖和感染，病原真菌产生大量的效应因子来调节寄主生理或逃避寄主细胞的识别。与细菌效应子通过III型分泌系统注入植物细胞不同，真菌效应因子既可在质外体也可进入植物细胞发挥毒性作用。据估计，导致作物黄萎病的大丽轮枝菌可编码700多种分泌型效应蛋白。虽然部分效应蛋白功能已被报道，然而迄今为止，大部分效应蛋白功能仍然未知。
本研究从海岛棉H7124诱导黄萎病菌强致病力菌株V991的转录组中鉴定到一个显著被根组织诱导表达的新型毒素蛋白，命名为VdTRP。该蛋白结构包括一段信号肽序列、一个非典型的真菌胞外膜蛋白（CFEM）结构域、一个新型的富含脯氨酸基序(IPGGCNPAHPGSCP)组成的四肽串联重复结构域和一段C端基序。农杆菌瞬时侵染试验表明，VdTRP可以快速且强烈的造成烟草、棉花和拟南芥叶片细胞死亡。而敲除VdTRP的V991突变菌株则显著降低了对棉花的致病力。研究表明，类CFEM结构域和四肽重复结构域对VdTRP的致毒性缺一不可。缺失类CFEM结构域减弱了VdTRP对烟草细胞的毒性，而缺失富含脯氨酸的四肽重复结构域导致VdTRP对烟草细胞的毒性完全丧失。氨基酸突变分析表明脯氨酸作为重要位点发挥关键的毒力作用，同时富含脯氨酸基序的串联重复数目与细胞的毒性程度显著相关。亚细胞定位显示VdTRP定位于细胞膜，类CFEM结构域是VdTRP细胞膜定位的关键结构域。体外脂结合试验证明，VdTRP的类CFEM结构域与细胞膜成分PS（磷脂酰丝氨酸）结合。进一步研究发现，纯化的VdTRP蛋白可以造成体外培养的H9c2大鼠心肌细胞死亡。扫描离子电导显微镜（SICM）的表面形貌检测与电荷同步检测发现，VdTRP导致H9c2细胞表面穿孔，发生离子泄露。上述实验结果表明VdTRP通过类CFEM结构域与PS结合靶向细胞膜，富含脯氨酸的四肽重复结构域发挥毒力作用使细胞膜穿孔，发生离子泄露，导致细胞死亡。
为了发掘棉花中可能抵抗VdTRP毒蛋白的靶标，研究进一步通过酵母双杂筛库结合多种蛋白互作手段证明VdTRP与棉花的类几丁质酶CTL1在体内外均相互作用。酵母双杂分段实验、GST pull down实验和微量热泳动分子互作实验证明，CTL1主要和VdTRP的C端基序互作。CTL1定位于质外体，VdTRP定位于细胞膜。然而，在烟草中共同表达CTL1和VdTRP蛋白，VdTRP细胞膜定位改变为质外体定位，同时VdTRP诱导细胞死亡的程度减缓。相反，在烟草中共同表达CTL1和缺失C端基序的VdTRP△C-terminal时，VdTRP△C-terminal的细胞膜定位没有改变，且VdTRP△C-terminal诱导细胞坏死程度也未明显减弱。这些结果表明CTL1可以在质外体与VdTRP的C端基序互作，阻止其靶向细胞膜诱导细胞死亡，进而提高植株抗病性。
研究发现，CTL1并不具有几丁质酶活性，对大丽轮枝菌也没有抑菌作用。转基因实验表明，在陆地棉中过量表达CTL1则显著增强了植株体内糖代谢水平，增加了本底水杨酸含量并减缓了VdTRP对棉花的毒性，显著提高了棉花对黄萎病的抗性。然而，RNAi干扰CTL1的转基因棉花则表现为植株生长发育严重影响，无法完成生长周期，获得后代。利用VIGS技术沉默CTL1，发现CTL1沉默的棉花植株出现细胞壁缺陷，茎“脆杆”和根发育减弱的表型。这些结果表明CTL1是棉花生长发育的必需基因。
综上所述，本研究揭示了棉花生长发育关键因子类几丁质酶CTL1参与黄萎病抗性的分子机制。CTL1在质外体与黄萎病菌新型毒性蛋白VdTRP相互作用，阻止VdTRP靶向细胞膜，减缓其对植株细胞膜毒性；过量表达CTL1显著增强植株体内糖代谢水平，激发植物细胞受体蛋白/激酶类基因上调表达，触发SA的合成并激活自身的免疫反应。研究为培育棉花抗病新品种提供了理论基础和基因资源。
图1. 质外体蛋白CTL1阻止新型毒蛋白VdTRP破坏细胞膜，诱导植株提高免疫，增强棉花对黄萎病抗性的工作模式图
利用VdTRP中IPGGCNPAHPGSCP重复基序为探针，搜寻公共数据库中不同类型真菌基因组序列，发现该基序在盘菌亚门中粪壳菌纲、座囊菌纲、锤舌菌纲和散囊菌纲等253种真菌中均保守存在，其重复数目从1-15不等。选择三种不同来源的效应蛋白进行毒性检测，发现均导致不同程度植株叶片萎焉。其中灰葡萄孢菌XP-001561412和VdTRP结构相似性高，含有信号肽、GPI膜锚定结构域和富含脯氨酸的重复基序，该效应蛋白致毒性强，对烟草细胞造成严重坏死。上述结果表明富含脯氨酸的重复基序在多种病原真菌的效应蛋白中具有相似的致毒作用，含有膜结合结构域的效应蛋白致毒性更高。
很多细菌、真菌和卵菌在侵染植物过程中都会分泌一种引发细胞凋亡的蛋白类毒素，这类毒素蛋白的发现与机理解析正越来越受到大家关注。针对前人广泛关注的坏死和乙烯诱导型蛋白NLP1，团队前期鉴定到过氧化物酶体定位的溶血磷脂酶GhLPL2，可抑制黄萎病菌毒素蛋白VdNLP1的毒力作用（Wang et al., 2023, The Plant Journal）。本研究鉴定了一个具有独特串联重复DOMAIN的黄萎病菌新型毒性蛋白，进一步解析了棉花类几丁质酶CTL1可作为靶标阻止病菌毒蛋白侵染的抗病机制。GhLPL2和CTL1均是棉花生长发育的必需因子。这两项研究的发现表明，植物可通过调控必需基因的表达，抵御蛋白毒素类效应因子对细胞的毒性，显著提高黄萎病抗病性。这是不同于PTI 和ETI免疫通路的另外一种提高作物抗病性的新策略。
南京农业大学棉花遗传与种质创新利用团队博士研究生柳汉桥为论文第一作者，郭旺珍教授和生命科学学院王心宇教授为论文共同通讯作者。已毕业硕士研究生张文姝参与了VdTRP敲除与恢复突变体创制与鉴定工作，已毕业博士研究生何庆飞、硕士研究生热衣拉·艾克木和许慧娟参与了转基因棉花创制工作。在读博士研究生郭展、王璐，钟山青年研究员李维希博士和王桂林博士也参与了部分研究工作。该研究得到农业生物育种国家科技重大专项、江苏省重点研发计划和江苏现代作物生产协同创新中心等项目资助。