白菜类蔬菜原产中国，是一种世界性的蔬菜作物，其富含矿物质、膳食纤维、维生素，对调节人体酸碱平衡、新陈代谢及预防疾病具有重要作用，深受人们喜爱。白菜的遗传转化效率低下，已成为严重制约其基因挖掘和功能研究的一大障碍。近些年来，生长发育调控因子极大地提高了其他物种的遗传转化效率。同时，发根农杆菌高效的侵染效率为改良白菜的遗传转化提供了新的思路。
近日，南京农业大学白菜系统生物学实验室在Plant Physiology杂志发表了题为“Efficient genetic transformation and gene editing of Chinese cabbage mediated by Agrobacterium rhizogenes”的研究论文。该研究利用了发根农杆菌介导共表达ZmWUS2-IPT-AtPLT5三个基因，结合可视化标记RUBY的筛选和CRISPR/Cas9系统，成功地在白菜中建立了一种无基因型限制的、简单高效的遗传转化和基因编辑系统，无需使用根癌农杆菌进行转化或激素进行芽再生。从种子萌发到愈伤组织诱导、芽再生和生根的整个过程可以在3个月内完成。这种转化方法可以克服白菜品种遗传转化的基因型依赖性，为白菜及芸薹属蔬菜作物的功能基因组学研究、基因编辑和种质创新提供了底盘技术。
该研究首先以不结球白菜品种‘四九菜心’为实验材料，含有ZmWUS2-IPT-AtPLT5和RUBY过表达载体的发根农杆菌（K599）侵染发芽5-6天的带子叶下胚轴，15-25天后在侵染部位长出根和愈伤，把带芽的红色愈伤继代培养，获得了红色阳性转基因植株，带有红色皱叶和多分枝表型，并且可以正常授粉和结籽，转化效率可达20.48%。研究人员进一步在更多的白菜材料，包括用传统方法难以转化的材料中测试该系统。令人欣喜的是，所有供试材料都在ZmWUS2-IPT-AtPLT5的作用下实现了遗传转化，转化效率在3.31%-15.55%。这些供试材料中包括白菜参考基因组材料NHCC001（苏州青，不结球白菜）和Chiifu（大白菜）以及多个用于育种的优良自交系。
研究者也将ZmWUS2-IPT-AtPLT5和CRIPSR/Cas9基因编辑系统整合到一起，并成功在白菜中实现了高效的基因编辑。通过对Phytoene Desaturase（PDS）基因的敲除，成功获得了白化植株，利用PCR和Sanger测序来确认白化再生植株的基因编辑，发现大多数突变由替换、短插入或缺失组成，证实了新开发的白菜遗传转化方法用于基因编辑的可行性。
南京农业大学园艺学院硕士生王耀龙为该论文的第一作者。南京农业大学白菜系统生物学实验室张昌伟副教授、侯喜林教授和北卡罗莱纳州立大学刘武生教授为该论文的共同通讯作者。南京农业大学园艺学院李英教授、刘同坤教授、吴寒副教授、王燕副教授、肖栋博士和王文龙、陈晓山、高瞻远、徐欢欢等研究生，上海农业科学院园艺研究所杨学东副研究员和南京苏曼等离子工程研究院有限公司的科研人员也参与了该项工作。该研究得到了国家重点研发计划子课题（2022YFD1200502）、江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目（JBGS[2021]064）、江苏高校优势学科建设工程项目和the Hatch project 02685 from the U.S. Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture的资助。该技术已申请国家发明专利，申请号：2024105625686。
文章链接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiae543