近日，农学院张文利课题组在 “Nucleic Acids Research”上发表了题为“The roles of DNA methylation on pH dependent i-motifs (iMs) formation in rice”的研究论文。该研究是在前期的研究基础之上（Nucleic Acids Res 2022, 50:3226-3238），再次利用iM-IP-seq方法，从全基因组水平较为系统地解析了水稻基因组DNA甲基化修饰水平和pH条件影响iMs结构形成的复杂关系。

在人和动植物基因组中，i-motifs（iMs）是一类普遍存在且十分重要的非B型DNA二级结构，其在维持基因组结构稳定性、DNA复制、基因转录和翻译等多种生物学过程中发挥着重要的调控作用。目前，多数研究发现，体外iMs的形成严格依赖于酸性pH环境，且DNA甲基化水平也可影响基因组部分位点的iMs形成。最新研究结果表明，在正常生理条件下也可形成iMs结构，但其形成的机理不清。迄今为止，不同pH条件如何影响iM的形成及其分布还鲜有报道。特别是DNA甲基化修饰水平和pH条件如何影响iMs的形成仍缺乏系统研究。该问题的解决将有助于人们理解在细胞正常生理条件下形成iMs的可能分子机制。

该研究首先利用iM-IP-seq方法，绘制了pH 5.5及pH 7.0 条件下水稻基因组iMs分布图谱。分别鉴定了33,455个pH 5.5和55,062个pH 7.0 特异的iMs位点。基因组分布结果显示，pH 7.0 特异的iMs位点主要分布于5’UTRs、基因间区、基因下游区域及内含子区域；相比之下，pH 5.5特异的iMs位点主要分布在外显子区域。

图1. pH 5.5及pH 7.0 条件下iMs鉴定及其在亚基因组分布

DNA甲基化水平的分析结果表明，pH 7.0 特异的iMs呈现出较高的甲基化修饰水平，与pH 5.5特异的iMs甲基化修饰水平明显相反。这一结果暗示，DNA甲基化水平可能是影响不同pH条件下iMs形成的关键因素之一。

图2. pH 7.0和 pH 5.5特异的iMs的甲基化修饰水平比较

进一步结合全基因组高低DNA甲基化的iM-IP-seq，发现DNA甲基化水平降低对pH 7.0条件下iMs形成的影响要大于pH 5.5的；而DNA甲基化水平升高则更不利于pH 5.5条件下iMs的形成。重要的是，我们发现只有一定程度的甲基化修饰水平有于不同pH依赖的iMs的形成，过高或过低的甲基化水平均不利于iMs的形成。

图3 高低DNA甲基化对pH 7.0和pH 5.5条件下iM形成的影响

最后，分析结果表明，在pH5.5和7.0条件下，CG-hypo-DMRs和CHH-hyper-DMRs单独或与CG/CHG-hyper-DMRs协同的作用，共同影响iMs的形成。

图4. pH协同高/低DNA甲基化影响iM的形成

本研究首次在全基因组水平，较为系统地研究了DNA甲基化和pH条件影响iMs形成的复杂关系，一方面初步阐明了细胞正常生理条件下形成iMs的可能分子机制，同时促进了水稻iMs生物学功能的研究及其潜在的应用价值。

南京农业大学钟山青年研究员冯逸龙和陶申童博士、已毕业硕士马星和在读硕士生杨滢为论文共同第一作者，张文利教授为通讯作者。南京农业大学程雪娇副教授以及博士留学生Asgar Ahmed，扬州大学龚志云教授等也参与了该研究。该研究得到了国家重点研发项目和国家自然科学基金等课题的资助。

本文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkad1245