田间棉铃虫幼虫取食棉铃。南京农业大学供图
■本报记者 李晨 通讯员 许天颖
在与寄主植物协同进化的过程中，昆虫形成的化学防御体系为杀虫剂抗性进化提供了遗传基础。然而，两者关联的分子机制尚不清楚。
30年来，南京农业大学教授吴益东团队潜心研究，终于破解了昆虫细胞色素P450单加氧酶（以下简称P450）在杀虫剂代谢抗性形成中的重要作用。他们通过对两种全球性害虫——草地贪夜蛾和甜菜夜蛾的P450基因功能进行系统解析，揭示了昆虫P450基因介导寄主植物适应性和抗药性进化的内在机制。相关研究成果近日在线发表于美国《国家科学院院刊》。
一度准备放弃的研究领域
棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目昆虫是危害我国棉花、蔬菜等重要经济作物的主要害虫。由于杀虫剂的不合理使用，这些害虫对包括拟除虫菊酯在内的多种杀虫剂都产生了高水平的抗性，从而造成了重大经济损失。
是什么让害虫对杀虫剂产生了这么强的抗性？这是科学家一直关注的问题。
“在昆虫与植物长期协同进化的过程中，植物通过产生次生物质防御昆虫侵害，昆虫则进化出解毒代谢酶应对植物的化学防御。P450就是植食性昆虫应对植物化学防御物质的一类重要解毒代谢酶，在植物次生物质解毒和杀虫剂代谢抗性形成中具有重要作用。”论文通讯作者吴益东告诉《中国科学报》。
他介绍，P450是存在于几乎所有生物体内的一种氧化酶，在昆虫体内参与内源性化合物，如激素/性信息素的合成/降解，以及外源有毒化合物，如杀虫剂/植物次生抗虫物质的解毒，介导昆虫的生长发育、寄主植物适应以及杀虫剂抗药性。
吴益东团队在上世纪末就已经通过生化手段明确，P450等解毒代谢酶介导的解毒能力提升，是造成我国以及亚洲多国田间棉铃虫种群对多种杀虫剂产生高水平抗性的主要原因。
“由于昆虫体内P450基因数量多，不同P450的底物谱可能相互重叠，因此明确P450和植物次生物质与杀虫剂解毒代谢之间的互作关系极具挑战性。”吴益东说，“此外，受限于技术手段，多年来具体介导抗性的关键基因一直无法明确，我们一度准备放弃该领域的研究。”
建“P450工厂”拉开基因功能研究序幕
好在吴益东团队一直没有放弃。经过多名研究生十几年的接力，在参考资料有限的情况下，该团队于2014年自主搭建了包括基因克隆、真核细胞表达、蛋白纯化、代谢活性定性/定量检测在内的P450基因离体功能研究平台。
经过多次技术迭代，他们建立了“P450工厂”，可以同时对多个P450基因的功能进行快速离体鉴定和比较，拉开了昆虫P450大规模基因功能研究的序幕。
首篇关于10个棉铃虫P450基因批量功能研究的论文2017年底发表于《昆虫生物化学和分子生物学》。
与此同时，吴益东团队率先将CRISPR-Cas9的体内基因编辑技术应用于农业昆虫抗药性基因功能研究中，实现了基因的敲除和敲入。
他们还根据解毒类P450基因成簇排列的特征，创新性地提出基因簇整体敲除+生物测定+单个基因离体表达的反向遗传学策略，快速鉴定了棉铃虫体内高度扩增的CYP6AE亚家族中单个P450与多种植物次生抗虫物质及杀虫剂解毒代谢之间的关系，提高了昆虫P450基因功能研究和抗性基因预测的效率。该成果2018年发表于《自然-通讯》。
逐一破解抗性机制的奥秘
有了研究平台“P450工厂”和独到的研究思路，吴益东团队开始快速破译害虫抗性机制的奥秘。
2021年，他们又破译了另一种重大害虫——甜菜夜蛾对阿维菌素类杀虫剂的抗性机制。该研究将遗传定位与基因组编辑，以及基因离体功能验证等多种技术进行组合，发现甜菜夜蛾基因组中一个P450基因的单个氨基酸位点突变介导了该虫对甲维盐和阿维菌素两种杀虫剂的高水平抗性。相关研究成果2021年发表于《公共科学图书馆-遗传学》。这表明该团队创立的基因编辑和P450离体研究平台在杀虫剂抗性机制解析方面发挥了重要作用。
最近，该团队再次利用自主创建的体内和体外基因功能研究平台，对两种全球性害虫——草地贪夜蛾和甜菜夜蛾体内发生特异性扩增的CYP9A亚家族基因功能进行了深度解析。
结果发现，该亚家族P450同时参与植物次生抗虫化合物和多种不同结构类型杀虫剂的解毒代谢，且与田间的拟除虫菊酯类杀虫剂的高水平抗性紧密关联。这不仅表明两种害虫体内CYP9A亚家族P450对不同结构杀虫剂产生交互抗性的潜力，也证实了CYP9A亚家族基因扩增为P450的功能创新及适应性进化提供了丰富的遗传多样性。相关研究成果近日发表于美国《国家科学院院刊》。
从追赶到超越，吴益东团队在昆虫P450研究中逐步达到了同领域国际先进水平，甚至在一些研究方向上领先。
2022年起，在国家重点研发计划的支持下，吴益东团队与国内许多害虫和植物病原菌抗药性的顶尖研究团队一起，将新的研究技术和思路应用于我国田间更多重要农作物害虫对新型药剂产生抗性的分子机制和进化机制研究中，以提升国内整体抗药性研究水平。同时，他们将研究成果应用于抗药性快速诊断等关键技术的研发，为我国抗药性早期预警和治理水平提高注入新力量。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1073/pnas.2308685120
原文链接：
https://news.sciencenet.cn/sbhtmlnews/2023/10/376704.shtm?id=376704
