6月29日，南京农业大学植物保护学院昆虫生理生化与分子生物学团队在国际生物学知名期刊PLoS Genetics 在线发表了题为“G3’MTMD3in the insect GABA receptor subunit, RDL, confers resistance to broflanilide and fluralaner”的研究论文。该研究利用计算生物学、电生理和CRISPR/Cas9基因编辑技术，揭示和验证了异噁唑啉类杀虫剂氟雷拉纳和间二酰胺类杀虫剂溴虫氟苯双酰胺在昆虫离子型GABA受体中的具体作用靶点，为解析其耐药性形成机制提供了新见解。

离子型GABA受体是昆虫神经系统中最主要的抑制性神经递质受体，也是重要的杀虫剂靶标。两类传统的GABA门控氯离子通道阻断剂——环戊二烯有机氯类杀虫剂（狄氏剂、硫丹等）和苯基吡唑类杀虫剂（氟虫腈、乙虫腈等），以及两类新型的GABA门控氯离子通道变构调节剂——异噁唑啉类杀虫剂（氟雷拉纳、异噁唑虫酰胺等）和间二酰胺类杀虫剂（溴虫氟苯双酰胺、环丙氟虫胺等），均通过作用于RDL亚基而发挥杀虫活性。前期体外及体内研究揭示了RDL亚基第二跨膜区（TMD2）的丙氨酸（A2’TMD2）突变是昆虫对狄氏剂（A2’STMD2）或氟虫腈（A2’NTMD2）产生靶标抗性的关键原因，但该位点突变并不影响重组RDL受体对异噁唑啉类或间二酰胺类杀虫剂的敏感性。后续体外研究结果表明，RDL亚基第三跨膜区第三位甘氨酸（G3’TMD3）可能是上述两类新型杀虫剂重要的作用靶点。然而，长期以来体内实验数据的缺乏，阻碍了对该药靶模型的充分验证。

本研究首先通过比对节肢动物RDL亚基与脊椎动物GABA受体亚基的氨基酸序列，结合同源建模、分子对接，在RDL亚基的4个TMDs中筛选出可能影响氟雷拉纳作用的12种突变。通过构建鳞翅目昆虫二化螟RDL亚基（CsRDL）突变体并进行异源表达与电生理检测，结果发现G3’MTMD3突变对重组RDL受体响应氟雷拉纳的影响最为显著，几乎失去了对氟雷拉纳的响应。黑腹果蝇、意大利蜜蜂和灰飞虱的RDL亚基G3’MTMD3突变体也存在相似作用，即表现为对氟雷拉纳敏感性下降显著。此外，小鼠GABA受体在相同位点的M3’GTMD3突变增加了其对氟雷拉纳的敏感性。为进一步体内验证G3’MTMD3突变的功能，作者选用只含单个RDL编码基因的经典模式生物——黑腹果蝇为试验对象，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在RDL亚基中敲入G3’MTMD3突变。然而，杂交结果表明G3’MTMD3突变纯合子无法存活，并导致无法获得突变纯合品系。利用黑腹果蝇的常规平衡染色体构建的杂合突变品系则对氟雷拉纳和溴虫氟苯双酰胺不具有抗性。为了解决这一难题，他们利用了携带GFP标记基因的平衡染色体重新构建了G3’MTMD3杂合突变品系，以逐一探究G3’MTMD3纯合突变的致死特性、产生耐药性的潜能及适合度代价。结果发现：（1）G3’MTMD3纯合突变体可正常孵化，但会在蛹期前死亡；（2）携带G3’MTMD3纯合突变的初孵幼虫对氟雷拉纳和溴虫氟苯双酰胺均具有极高水平（＞900倍）抗性；（3）G3’MTMD3纯合突变导致幼虫运动能力下降。

综上所述，该研究证明了异噁唑啉类杀虫剂氟雷拉纳和间二酰胺类杀虫剂溴虫氟苯双酰胺均作用于昆虫GABA受体RDL亚基G3’TMD3位点，并首次揭示了昆虫对这两类新型杀虫剂的靶标抗性产生与适合度代价之间的权衡机制。

硕士毕业生张一弛和在读博士生黄秋堂为论文共同第一作者，赵春青教授为论文的通讯作者；安徽农业大学盛成旺副教授、武汉工程大学刘根炎教授、湖南省农科院植保所唐涛研究员、南京农业大学韩召军教授和英国牛津布鲁克斯大学Andrew K. Jones博士参与了该项研究。本研究由国家自然科学基金（31871995）和国家重点研发计划（2022YFD1400900）资助。

论文全文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010814